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　　ELISA雙抗體夾心法關鍵步驟詳解

　　以下是本生技術小編對ELISA雙抗體夾心法的關鍵步驟詳解，結合操作要點和注意事項進行結構化說明：

　　一、實驗原理概述?

　　雙抗體夾心法通過?兩種特異性抗體?(包被抗體和酶標抗體)結合抗原的不同表位，形成“夾心"結構，最終通過酶催化底物顯色實現定量分析?。適用于檢測二價或以上大分子抗原?。

　　二、關鍵操作步驟?

　　1. ?包被抗體?

　　固相載體準備?：選擇聚苯乙烯酶標板(需驗證蛋白結合能力)，pH 9.0-9.6緩沖液稀釋抗體至濃度(需預實驗滴定)?。

　　包被條件?：4℃過夜孵育或37℃ 2小時，確保抗體充分結合?。

　　2. ?封閉未結合位點?

　　使用1-5% BSA或脫脂牛奶封閉，37℃孵育1小時，減少非特異性吸附?。

　　3. ?加樣與孵育?

　　標準品/樣本?：每孔加入100μL，37℃孵育1小時，確保抗原與包被抗體結合?。

　　洗滌?：PBS洗滌4-6次，每次30秒，拍干后保持孔內濕潤?。

　　4. ?酶標抗體反應?

　　加入生物素化抗體(與包被抗體結合不同抗原表位)，37℃孵育1小時?。

　　再次洗滌后，加入HRP-鏈霉親和素(若使用信號放大系統)?。

　　5. ?顯色與終止?

　　加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘，觀察梯度顯色?。

　　加入2Mliusuan終止反應，藍色立轉黃色?。

　　三、注意事項?

　　抗體配對?：包被抗體與酶標抗體需識別抗原不同表位，避免交叉反應?。

　　樣本處理?：避免溶血或纖維蛋白干擾，離心去除顆粒物?。

　　洗滌控制?：推薦自動化洗板機(350μL/孔，震板5秒)，減少背景噪聲?。

　　通過規范操作可顯著提高實驗重復性，避免鉤狀效應(高濃度抗原導致假陰性)?。

　　注：以上資料僅供參考，如需進一步了解產品詳情，可參考品牌供應商或技術老師。

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